组织处理的进展现在允许快速而一致地标记完整、完整的啮齿动物大脑及其他大型样本中的单个细胞水平的蛋白质，效果与在孤立的单个细胞中一样有效。
来自麻省理工学院的一项突破性技术使研究人员能够在完全完整的3D组织中以卓越的速度、一致性和适应性标记数百万个单个细胞中的蛋白质。得益于这一创新，团队能够在仅一天内广泛标记完整的啮齿动物大脑及其他实质性组织样本。他们最近在《自然生物技术》上的出版物证实，整个大脑中以单细胞水平使用抗体标记蛋白质可以揭示传统标记技术所掩盖的洞察。
分析细胞产生的蛋白质在生物学、神经科学和相关领域至关重要，因为细胞在任何时刻表达的蛋白质可以指示其功能或对疾病或治疗等条件的反应。尽管显微镜和标记技术的重大进展导致了无数发现，但研究人员一直难以有效跟踪在完整的3D完整组织（如完整的小鼠大脑或人脑的完整区域）内的数百万个密集细胞中的蛋白质表达。通常限制于在载玻片下观察的薄组织切片，科学家们缺乏必要的工具来全面理解统一和连接的生物系统中的蛋白质表达。
“传统上，研究细胞内的分子需要将组织分解为单个细胞或切成薄片，因为分析所需的光和化学物质无法深入组织。我们的实验室开发了诸如CLARITY和SHIELD等技术，通过使整个器官透明来检查整个器官，但我们现在需要一种化学标记整个器官以获得有价值的科学见解的方法，”研究的资深作者、麻省理工学院皮考尔学习与记忆研究所的副教授Kwanghun Chung解释道，此外还包括化学工程和脑与认知科学系，以及麻省理工学院医学工程与科学研究所。“想象一下将厚牛排在酱汁中稍作浸泡。外层迅速而强烈地吸收腌制液，而内部层基本保持不变，除非浸泡时间较长。化学处理组织的概念是相同的：如果组织内的细胞没有得到一致处理，就无法进行定量比较。蛋白质标记的挑战更加复杂，因为我们用于标记的化学物质显著大于腌制液中的那些。因此，这些分子可能需要数周才能扩散到完整的器官中，从而使大组织样本的均匀化学处理几乎不可能且非常缓慢。”
新开发的“CuRVE”技术标志着一项重大的进展，这是多年来的成果，它展示了一种根本不同的方法来均匀处理大型和密集的组织。在他们的研究中，研究人员描述了他们如何使用一种名为“eFLASH”的CuRVE版本克服各种技术挑战，并展示了这一技术的开创性演示，强调了其在新型神经科学发现中的潜力。
“这代表了一项显著的进步，特别是在技术的实际性能方面，”共同首席作者、大希云评论道，他曾是麻省理工学院的研究生，现在担任LifeCanvas Technologies的高级应用工程师，这是一家由Chung创办的初创公司，旨在传播他实验室开发的创新。另一位首席作者Young-Gyun Park是麻省理工学院的前博士后，现在是韩国KAIST的助理教授。
巧妙的化学
均匀标记大型3D组织样本的主要挑战在于抗体在组织中的缓慢渗透，而它们对目标蛋白的结合速度却很快。这种速度的不匹配导致了一个情景：简单地将大脑浸泡在抗体溶液中会导致外层的蛋白质强烈标记，但深层细胞和蛋白质的标记则很少。
为了增强标记，团队设计了一种概念，概括了CuRVE的本质：一种在同时加快抗体渗透组织的同时持续管理抗体结合速度的策略。他们创建并执行了一种先进的计算模拟，以测试各种参数，包括结合速度和组织成分。
接下来，他们将方法应用于实际组织，基于一些先前的技术，称为“SWITCH”，在该技术中，Chung的实验室找到了一种方法可以暂时停止抗体结合，让抗体渗透组织，然后重新启动结合过程。尽管取得了成功，但云注意到，如果他们能够持续控制结合速度，将有可能显著改善。然而，SWITCH中使用的化学品对持续应用过于严苛。团队随后筛选出一系列类似物质，以发现一种能够微妙且持续调节结合速度的化学物质，最终选择了脱氧胆酸作为最佳候选物。通过使用此化学物质，团队可以通过改变其浓度和标记溶液的酸度（pH）来调整抗体结合。
为了促进抗体在组织中的更快移动，他们还使用了Chung实验室的另一项早期创新：随机电传输，利用施加电场加速抗体在组织内的传播。
应用eFLASH系统进行快速分散，并结合持续可调的结合速度，导致了他们研究中报告的众多标记成功。总的来说，研究人员利用60多种不同的抗体在小鼠和大鼠的完整大脑、完整的小鼠胚胎、各种小鼠器官（如肺和心脏）以及来自更大物种（包括人类）的脑组织块中标记蛋白质。
值得注意的是，所有这些标本均在一天内标记完成，作者们将其形容为“超快”的完整器官。此外，每个准备过程均不需要新的优化步骤。
有价值的可视化
在使用eFLASH进行的测试中，包括与另一种常见技术的比较：对细胞进行基因工程，使其在目标蛋白质基因被转录时发出荧光。虽然基因方法不需要抗体散布在组织中，但由于基因转录并不总是与实际蛋白质产生直接相关，因此可能会出现差异。正如云所指出的，抗体标记提供了对目标蛋白质存在的可靠和即时指示，而基因方法可能不够及时，并且即使在蛋白质不再存在后仍可能持续发光。
在他们的研究中，团队同时利用这两种标记方法。通过这种双重可视化，他们发现抗体和基因标记结果之间存在显著差异。在小鼠大脑的某些区域，他们发现通过抗体标记显示PV（某些抑制神经元的显著蛋白质）表达的三分之二的神经元在基因方法中并未显示出任何荧光。在另一种情况下，仅有极少量的细胞通过基因方法展示的ChAT蛋白质表达同时被抗体标记识别。这表明基因标记在某些情况下可能显著低估或夸大了与抗体标记相比实际的蛋白质表达。
研究人员并不打算贬低基因报告技术的实用性；相反，他们倡导在eFLASH的支持下包括全器官抗体标记，以为数据提供更广泛的背景。例如，由于他们注意到小鼠中PV表达的严重过度报告（个体间存在显著差异），使用PV的整个大脑抗体标记的研究人员可以获得更深入的理解，以分析基因指示的蛋白质变化。
“我们关于健康成年小鼠中PV免疫反应性神经元的大规模区域损失的发现，具有很高的个体变异性，突出了全面和无偏见表型特征的重要性，”作者们指出。
正如云所表达的，两种标记形式可视为“工作上的不同工具”。
除了云、朴和钟外，论文列表中还有其他作者：赵亨和、李卡门斯基、尼古拉斯·埃文斯、尼古拉斯·迪纳波利、凯瑟琳·谢、崔秀宇、亚历山德罗·阿尔巴内斯、田宇轩、宋昌浩、张强哥、金敏永、贾斯廷·斯威尼、韦伯斯特·关、朴柱赫、加比·德鲁蒙、崔熙珍、卢斯达里·鲁埃拉斯和冯国平。
该研究得到了包括巴罗赫斯·韦尔卡姆基金会、赛尔奖学金计划、帕卡德科学与工程奖、NARSAD青年研究者奖、麦克奈特基金会、自由共生基金会、皮考尔学习与记忆研究所、NCSOFT文化基金会以及国立卫生研究院等多家组织的资助。
