抗生素耐药性是一个全球性问题，威胁着我们预防和治疗人类和动物细菌感染的能力。为了更好地监测耐药性的出现和传播，卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所的研究人员开发了一种CRISPR增强的宏基因组学方法，用于加强对废水中抗生素耐药基因（ARGs）的监测。
抗生素虽然是对抗感染的强大现代工具，但细菌会随着时间的推移对抗生素的暴露进行变化和适应，因此降低了其有效性。在医疗和食品行业中，抗生素的广泛过度使用和误用进一步加速了这个问题。
除了直接暴露于抗生素之外，耐药性还通过转移称为抗生素耐药基因的小片段细菌DNA在不同细菌之间传播。已识别的ARGs超过5000种，这些基因可以在临床样本中发现，也可以在来自医院、农场和污水处理系统的水体中找到。
伊利诺伊大学香槟分校土木与环境工程教授海伦·阮（Helen Nguyen）表示：“ARGs可以降低用于治疗细菌感染的药物的拯救生命能力。废水中具有临床意义的ARG检测使公共卫生机构和医生能够预见社区中正在传播的内容。”
废水中含有大量不同的ARG，混合了来自人类、病毒和细菌的遗传物质。由于ARG只占总DNA含量的一小部分，在废水样本中揭示它们需要敏感的检测方法。最常用的技术是定量聚合酶链反应（qPCR）。该方法使用称为引物的RNA引导物来识别已知ARG的特定DNA序列，然后进行扩增以便检测。
“qPCR是一种敏感的方法，许多公共卫生人员都经过良好的培训，但它需要设计和验证引物，这非常耗时，”博士生毛宇青说，她是该论文的第一作者。“由于qPCR用于提取目标基因序列，因此样本中的其他遗传物质完全未知。”
第二种方法，宏基因组学，虽然不如qPCR灵敏，但能够捕获样本中遗传信息的更完整的故事。宏基因组学涉及将所有样本DNA分解成数百万个较小的片段，这些片段同时使用下一代测序技术进行测序。计算算法拼接完整的DNA序列以与数据库进行比较，确定其身份。
毛宇青表示：“ARGs在样本中的DNA占比不到百分之一——可能更接近0.1%——使用标准的宏基因组学方法，99.9%的检测到的DNA与ARG无关。”
为了提高样本中与ARG相关的片段的丰度，毛宇青、阮和她们的合作者、伊利诺伊大学微生物学系的乔安娜·希斯勒（Joanna Shisler）利用了CRISPR-Cas9系统——一种高效的基因编辑工具。使用标准宏基因组学方法时，DNA在随机位置被碎片化，但引入CRIPSR-Cas9允许在ARG内进行靶向碎片化。通过设计6010种不同的引导RNA，使其能够特异性结合ARG中的不同位点，Cas9蛋白可以被指引在这些位置切割。
毛宇青说：“我们新的CRISPR方法增加了样本中ARG片段的丰度，从而提高了它们被读取和检测的机会。与PCR等方法相比，CRISPR在多重检测中的潜力更好，因为CRISPR的分子相互作用简单明了。”
他们的新方法将ARG的检测限降低了一个数量级，从10^-4降至10^-5，发现了1189个额外的ARG和61个在废水样本中丰度低的ARG家族。
作为一名六年级的研究生，毛宇青从头开始构建这个项目——克服科学障碍，并在过程中学习许多新技术。她说：“第一次得到测序结果时，我从未想过它会比常规方法敏感得多——它检测到了比我们预期的更多的ARG。在完成项目后，我感觉自己成长了。”
但虽然这项工作已经结束，毛宇青和阮已经在追求多个新方向，包括将她们的CRISPR-Cas9宏基因组学方法扩展到更广泛的环境样本，并利用她们的结果指导新qPCR引物的设计。
