圣犹达儿童研究医院的科学家们找到了解决长期存在的通过单分子荧光共振能量转移（smFRET）进行准确分子尺度距离测量问题的方法。smFRET测量荧光染料的激发和发射特性，一种化学物质。
荧光染料在激发电子放松时会发出光，从而使分子发光（荧光）。科学家的这一突破解决了数十年来的问题，并将导致更精确的实验。马的激发后并不总是发光。相反，它们会进入长寿命的三重暗态，这些暗态由于与激发电子的“自旋”状态相关的量子力学过程而不发光。这可能降低smFRET测量的准确性。圣犹达的科学家们找到了一种通过“自我修复”技术控制这些暗态持续时间的方法，从而减轻三重暗态。这一进展显著提高了该方法的分辨率，并将为分子成像领域做出贡献。研究结果发表在《自然方法》杂志上。
使用高帧率的专用相机和细致的照明，可以捕捉到蜂鸟翅膀快速运动的瞬间而没有任何模糊。然而，视觉化蜂鸟的飞行与捕捉我们体内生物分子的动作相比则困难得多。生物分子的尺寸极其微小，甚至小于光的波长（约十亿分之一英寸），它们的功能直接与其不断的运动相关，不断改变位置或形状（构象），每秒数百到数千次。能够测量这些快速动态对于真正理解分子如何执行其功能以及这些功能最终如何影响我们的身体至关重要。在疾病中，科学家们对生物分子受到的影响以及药物治疗如何改变其功能感兴趣。名为smFRET的分子成像技术允许直接观察生物分子在实时和单个分子层面的运动。
在圣犹达，斯科特·布兰查德博士在结构生物学和化学生物学与治疗学部门工作，致力于推进smFRET成像。布兰查德实验室的努力与圣犹达单分子成像中心的合作，对于开发和设计使分子级别测量成为可能的荧光染料至关重要。
布兰查德表示，典型的荧光染料不足以测量分子级别的事件，这促使他们创造自己的荧光染料。在这一过程中，他们发现荧光的基本光物理性质需要被修改。在smFRET实验中，研究人员将在生物分子的两个位置上放置荧光染料。当激光指向第一个荧光染料（供体）时，其中的一个电子被激发。如果第二个荧光染料（受体）很近，那么当电子放松时，能量会转移到它上。通过捕捉和测量供体和受体荧光染料的明亮闪光，可以测量出一个十亿分之一英寸的距离。每一个数据对理解生物过程是如何运作的以及它们何时出现问题都至关重要。然而，正确使用这一技术需要对荧光的基本属性有透彻的了解。
电子自旋翻转锁定在三重态
荧光染料释放光的机制主要由电子自旋决定。当一个激发的电子放松时，它应该回到其原始状态，保持一致的位置。根据布兰查德的说法，电子的自旋状态，也称为自旋量子数，在激发时可以改变。虽然这种情况并不总是发生，但存在电子可能忘记其自旋并切换到相反自旋状态的可能性。如果发生这种情况，电子最终将进入一个寿命更长的三重态，使荧光染料的亮度大大降低。这种现象多年来一直是荧光领域的一大挑战。布兰查德解释说，在FRET的背景下，他们观察到了三重态积累随照明强度和不同荧光染料的变化。FRET要求供体和受体荧光染料以相似的方式表现。然而，由于该技术涉及直接激发一个而非另一个，增加激光强度导致供体和受体的三重态占用率不同。
这导致供体和受体达到不同的平台水平，使它们以不同程度的性能损失表现。根据布兰查德的说法，这使得实验读数变得不一致。荧光染料三重态的变异性可能导致成像数据的质量和一致性问题，限制了smFRET测量的空间和时间分辨率。荧光染料工程研究的一个主要目标是尽可能减少三重态的寿命，这也是“自我修复”技术的基础。目前，smFRET数据中距离测量的准确性依赖于不考虑三重态的校准步骤，正如圣犹达结构生物学部门的共同第一作者泽利哈·基利奇博士所解释的。“自我修复技术的进步使我们更接近理想条件，三重态被消除，导致更准确的校准步骤和距离测量。”
自我修复荧光染料引领潮流
被称为三重态淬灭剂的化学物质，如环辛四烯，针对这种现象起作用，但也有导致复杂性的缺点。“环辛四烯是油性物质，溶解度不一致且较差，难以管理，”布兰查德说。
布兰查德团队的先前报告详细描述了将环辛四烯直接附加在荧光染料上的方法。这种方法解决了溶解度问题，并创造了“自我修复”荧光染料，使三重态的占用减少了最多1000倍。研究人员显示，在smFRET实验中使用自我修复荧光染料改善了数据质量和可靠性，并防止了激光强度增加时成像质量的降低。这些进展推动了smFRET的边界，自我修复荧光染料技术正在全球范围内被应用于各种领域。
“自我修复荧光染料的亮度和光稳定性的提升可以显著增强smFRET成像的时空分辨率。”共同第一作者阿维克·帕提博士，曾在圣犹达结构生物学部门工作，现在在比尔拉科技与科学学院工作，他表示。“我们现在能够在亚毫秒的间隔和生理氧水平下，准确测量单个生物分子内部纳米级构象动态。”
布兰查德认为，这些发现不仅将惠及圣犹达的研究人员，也将造福更广泛的科学界。“推进圣犹达成像技术的边界是该机构战略计划的重要组成部分，我们相信这些进展将产生积极的影响。”发言人强调使用新荧光染料实现他们目标的重要性。他还提到，许多人将从这些进展中受益，因为自我修复的方法有潜力提升大多数荧光应用。
