生物传感器技术的一项重要进展使得能够快速、清晰地检测各种环境中的生物标志物，这得益于“结合激活荧光生物传感器”的发展。一项合作研究努力创建了一个合成生物学平台，简化了此前复杂且昂贵的发现、进化和生产这些生物传感器的过程，为生物医学和环境领域的众多新机会铺平了道路。
生物传感器——利用生物分子识别特定物质的设备——在识别疾病生物标志物、跟踪生物过程中的活性分子以及检测我们周围的毒素和其他有害物质方面具有很大潜力。在最常见的类型中，荧光生物传感器由一个靶标结合生物分子连接到一个发射荧光光的探针构成。然而，传统的荧光生物传感器通常提供的信号较弱，因为它们的荧光探针始终“开启”，需要洗去未结合的生物传感器分子才能获得准确的读数。
“结合激活荧光生物传感器”（纳米传感器）的发展标志着一项重大改进，因为这些传感器仅在与其靶分子结合时才会发光。然而，制造这种纳米传感器的过程相当复杂，因为需要将有效的靶标结合机制与激活荧光的开关结合，同时确保它们紧凑、易于传递且生产成本低。
来自哈佛大学韦斯研究所、哈佛医学院、麻省理工学院和爱丁堡大学的研究团队推出了一个合成生物学平台，简化了小型但强大的纳米传感器的发现、进化和成本有效生产。这些传感器能够通过在短短的几分之一秒内增强其荧光强度达到100倍来识别特定的蛋白质、肽和小分子。该平台的核心是使用新型的荧光氨基酸（FgAAs），这些氨基酸可以通过一种创新的方法集成到靶标结合的小蛋白序列（结合子）中，该方法能够实现遗传密码的体外扩展。该平台的高通量筛选、验证和定向进化过程促进了蛋白结合子向高对比度纳米传感器的快速且经济的发展，适用于基础研究、环境监测、医疗诊断和改进的治疗实践。该研究的结果在自然通讯上进行了报告。
韦斯核心教员成员和本研究的领导者乔治·丘奇博士表示：“我们长期以来一直专注于扩展细胞内的遗传密码，以赋予它们用于研究、生物技术和医学的新功能，而这项研究是在体外努力的有希望的延伸。这个尖端的合成生物学平台克服了许多之前阻碍蛋白质与新化学功能增强的障碍，导致更有效的即时生物传感器，可能影响众多生物医学领域。”丘奇还是哈佛医学院的罗伯特·温索普遗传学教授，并在哈佛大学和麻省理工学院担任健康科学与技术的联合职务。
结合蛋白质和支架以创建纳米传感器
研究团队由联合第一作者厄尔金·库鲁博士领导，基于早期的发现，即FgAAs可以将已知的蛋白结合子转化为光学传感器，当FgAA位于结合子序列与靶分子之间时激活荧光。他们与爱丁堡大学的联合通讯作者马克·温德雷博士合作，后者是一名转化化学和生物医学成像专家，库鲁与他最初对FgAAs有共同的兴趣。
在大流行期间开始项目时，团队最初旨在创建一种“即时COVID-19诊断”，利用一种设计用于结合SARS-CoV-2 Spike蛋白的小型工程抗体（纳米抗体）。他们通过将半胱氨酸或赖氨酸氨基酸化学连接到靠近Spike靶标的20种不同荧光支架中的一种，产生了数百种结合子变体。通过一个简单的结合试验，他们选择了那些在靶结合后毫秒内产生最大荧光增加的荧光变体。
随后，他们利用相同的方法从纳米抗体或小蛋白质中工程出纳米传感器，针对SARS-CoV-2病毒的不同位点，以及癌症相关的细胞生长因子受体EGFR、生物学家偏好的ALFA标记肽用于蛋白追踪、以及压力激素皮质醇。值得注意的是，这些纳米传感器在显微镜下有效地指示了人类细胞和活细菌内靶标的存在，展示了它们作为强大成像工具的潜力。
纳米传感器技术的进步
尽管最初的平台显示出前景，但由于涉及多个纯化步骤的劳动密集和耗时的过程，限制了其效用。库鲁表示：“我们希望通过增强平台的高通量能力来极大地拓宽我们的设计可能性。”为了实现这一目标，他们调整了核糖体的能力——核糖体自然合成所有细胞蛋白质——以处理工程化的无细胞过程中的大多数任务。
在升级版本的平台中，研究人员合成了一种已经连接了荧光支架的“合成氨基酸”。合成氨基酸在治疗中显示出了显著的前景，例如减肥药Ozempic；然而，由于缺乏自然过程，尚难以将其融入蛋白质序列中，使其能够被核糖体管理。联合第一作者乔纳森·里提契尔博士解释道：“我们通过使用一种新颖的遗传扩展化学方法重新分配一种在普遍遗传密码中未被充分利用的密码子，来解决这个问题，从而使其能够编码合成氨基酸，例如我们预制的FgAAs。本质上，我们修改了蛋白质合成框架，以促进结合激活荧光纳米传感器的创建。”
这种新方法使研究人员能够同时生产数百万个纳米传感器候选者，并提高了测试效率，因为整个合成混合物可以直接添加到靶分子或活细胞中，无需进一步纯化。因此，他们能够在一天内检查数百个变体，而不是几周只检查几十个。升级平台的能力使他们能够识别FgAAs在最初的SARS-CoV-2纳米抗体结合子中的特定结合位点，意外地导致在与Spike靶标蛋白相互作用时发现了一个具有更高亲和力的纳米传感器。
为了进一步提升优质纳米传感器的开发，团队利用其新优化的平台，通过一种名为“定向进化”的传统合成生物学技术对纳米抗体序列进行了精炼，该技术通过迭代设计-构建-测试周期不断改善蛋白质，逐步选择最佳蛋白质变体以发现更有效的蛋白质。他们开始时以最优的纳米传感器为基础，旨在识别最初的SARS-CoV-2株的Spike蛋白。库鲁、里提契尔及其团队开发了大型纳米抗体文库。这些文库在原位保留非标准的FgAA，同时在其他重要位置上用结构上不同的替代物替换各种传统氨基酸。通过进一步进化最有效的纳米抗体，他们创造了对Spike蛋白表现出显著更高结合亲和力的新纳米传感器。值得注意的是，通过修改其定向进化方法，他们能够识别出能够选择性地检测不同近期Omicron变种的纳米传感器。
温德雷表示：“这标志着我们在快速创建低成本荧光生物传感器以进行实时疾病监测方面的重大进展，这为诊断和精准医学提供了巨大的可能性。”库鲁提到：“我们还可以将功能多样的合成氨基酸整合到各种蛋白质中，以开发新疗法和更广泛的研究工具。”库鲁和共同作者海伦娜·德·普吉博士及艾莉森·弗洛雷斯与丘奇及高级作者詹姆斯·柯林斯博士合作，开始了韦斯研究所的AminoX项目，利用该平台开发新疗法。
韦斯研究所创始主任唐纳德·英戈伯医学博士、哲学博士对这项工作给予了表扬，他表示：“这项开创性的研究为新一系列更强大的结合激活生物传感器铺平了道路，突显了合成生物学的非凡能力。韦斯团队有效地将一种基本生物过程转化为一个多功能平台，具有解决众多诊断和治疗挑战的巨大潜力。”英戈伯还担任哈佛医学院和波士顿儿童医院的朱达·福克曼血管生物学教授，以及SEAS的汉斯约尔格·韦斯生物启发工程教授。
其他为本研究贡献的人员包括Subhrajit Rout、Isaac Han、Abigail Reese、Thomas Bartlett、Fabio De Moliner、Sylvie Bernier、Jason Galpin、Jorge Marchand、William Bedell、Lindsay Robinson-McCarthy、Christopher Ahern、Thomas Bernhardt和David Rudner。该研究得到了韦斯研究所验证项目、美国能源部拨款（奖项编号#DE-FG02-02ER63445）、欧洲研究委员会整合拨款（奖项编号#DYNAFLUORS, 771443）和授予库鲁的生命科学研究基金会奖学金的支持。
