大脑疾病，如帕金森病（PD）或阿尔茨海默病（AD），在患者首次出现临床症状之前很早就开始发展。在这些早期阶段治疗患者可能会减缓或甚至停止他们的疾病，但目前尚无方法在这些无症状阶段诊断大脑疾病。例如，由帕金森病引起的特定大脑损伤只能通过分析脑活检才能检测到，而这种活检只能在患者去世后进行。
为了解决这一关键的瓶颈，研究人员一直在追求“液体活检”的新概念，该概念涉及通过非侵入性程序轻松提取血液或其他体液，并分析它们中源自大脑和其他固体组织的分子。体液中特别有前景的目标是“细胞外囊泡”（EVs），这些囊泡是由大脑和其他细胞释放到周围液体中的微小膜包囊。这些囊泡中含有多种分子，这些分子可能是特定于产生它们的细胞类型的，因此也可能携带保护性的生物标志物，以检测帕金森病和其他大脑疾病的早期表现。
然而，尽管最近取得了进展，但EV专家尚未能够解决一个问题，即他们在分离的EVs中测量的特定生物标志物分子是严格包裹在EVs内部，还是非特异性地附着在其表面。这个挑战实际上阻碍了他们能够对来自所有类型组织的EVs内的货物分子做出明确的结论。
现在，哈佛大学韦斯研究所和波士顿布里根和妇女医院（BWH）由大卫·沃尔特博士领导的一个合作团队通过在已经验证的超灵敏协议中添加关键步骤，解决了这个问题。通过酶解去除纯化EV群体中的所有表面结合的蛋白质，他们能够专门锁定EV内部保护的货物，同时消除非特异性“污染”。首次使用增强协议在血液中测量帕金森病生物标志物α-突触核蛋白时，他们能够准确确定EVs中任何蛋白质的小部分与总血浆中游离存在的比例。
重要的是，他们将这一进展与一种新开发的超灵敏检测方法相结合，该方法能够检测到在帕金森病及相关疾病路易体痴呆的进程中逐渐磷酸化的α-突触核蛋白。在分析一组患者样本时，他们发现EVs中病理性α-突触核蛋白相较于总血浆的含量富集。这项研究结果发表在《国家科学院院刊》（PNAS）上。
从血液到EVs再到生物标志物再到诊断
受到EVs在帕金森病、阿尔茨海默病和其他大脑疾病早期诊断前景的特别激励，沃尔特团队一直在系统性地将关键部分填入这个技术拼图。 在Good Ventures、Chan Zuckerberg Initiative和最近的迈克尔·J·福克斯基金会的慈善支持下，他们之前开发了一种量化EVs的技术框架，并利用这种量化比较了来自体液的EV分离方法。他们的方法结合了一种称为大小排斥色谱（SEC）的分离技术，用来从生物液体中回收大部分EVs，以及“超灵敏Simoa测定法”，使他们能够计数与他们捕捉和用特定抗体可视化的EVs相关联的单个蛋白质分子。到目前为止，团队已为多种EV特异性生物标志物设计了Simoa测定法，并且，重要的是，排除了广泛使用的候选表面蛋白L1CAM，作为分离脑特异性EVs的目标，从而为该领域提供了重要的方向修正。
“为了回答一个概念上简单但在技术上具有挑战性的问题，即在血浆中某种给定蛋白质（如α-突触核蛋白）的百分比相对于EV内部与外部的分布，我们使用了我们之前开发的SEC分离方法，从血浆中分离大部分EVs，结合优化的‘蛋白酶保护测定’，我们使用酶温和但有效地去除分离EV表面的所有蛋白，同时保持膜封闭的EV内部完好无损。”共同第一作者、韦斯研究所高级科学家Dima Ter-Ovanesyan博士说道，他与共同第一作者、博士后Tal Gilboa博士共同领导EV项目。
此外，为了在非常低的水平下测量α-突触核蛋白，Gilboa与博士后Gina Wang博士和韦斯研究助理Sara Whiteman在沃尔特实验室一起开发了一种比以往报道的任何测定法更灵敏的α-突触核蛋白Simoa测定法。利用该测定法，团队能够确定，使用他们的SEC协议分离的EVs中大多数的α-突触核蛋白是受保护的，并且这种数量占总血浆α-突触核蛋白的比例不到5%。理解这一数量对于最终在神经元衍生的EVs中测量α-突触核蛋白的目标尤其重要，因为来自特定组织（如大脑）的EVs预计相较于血细胞（α-突触核蛋白也在其中表达）的EVs将是稀有的。
重要的是，除了他们超灵敏的Simoa测定法使他们能够检测到正常的未修饰的α-突触核蛋白外，他们还开发了一种能够在帕金森病进展过程中检测在特定位点（pSer129）磷酸化的α-突触核蛋白的测定法。“当我们将我们的先进方法应用于来自帕金森病和路易体痴呆患者以及健康对照供体的血样时，我们发现，相较于EV外部，EV内部磷酸化的α-突触核蛋白的比例是总α-突触核蛋白的两到三倍。”Gilboa说。“这非常令人兴奋，因为这表明EVs可能保护蛋白质的磷酸化状态不被循环中的磷酸酶所破坏，这种磷酸酶将消除这一高度信息化的标记。”目前，团队正在进一步探索这些测定法是否可以用于区分帕金森病患者与非患者。
“沃尔特博士团队的工作展示了一项技术上的壮举，使我们离下一代具有非凡潜力的诊断平台越来越近。从目前来看，我们已经非常接近于使用这些极为丰富且富有启发性的细胞衍生囊泡，作为不需要手术即可观察患者大脑的窗口。”韦斯创始主任、医学博士、哲学博士Donald Ingber说道，他同时也是哈佛医学院和波士顿儿童医院的《犹大·福克曼血管生物学教授》以及哈佛约翰·A·保尔森工程与应用科学学院的《汉斯·约尔格·韦斯生物启发工程教授》。
论文的其他作者包括韦斯核心教员George Church博士，哈佛医学院罗伯特·温瑟普遗传学教授，以及宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院神经学教授Alice Chen-Plotkin博士，他们自EV项目开始以来与沃尔特团队合作，以及George Kannarkat。该工作得到迈克尔·J·福克斯基金会（拨款编号#2021A017224）、Chan Zuckerberg Initiative神经退行性疾病挑战网络和Good Ventures的资助。Gilboa是维兹曼科学研究所女性博士后职业发展奖的获奖者。
