最近的一项进展使研究人员能够在一次实验中检查数千种称为核糖酶的RNA酶的功能。“RNA世界”理论认为，地球上最初的生命形式可能依赖于RNA，这是一种单链分子，类似于DNA，并与一些现代病毒具有相似特征。与DNA类似，RNA传递遗传信息；然而，它还可以作为酶，促进或加速化学反应。尽管少数RNA酶或核糖酶已经单独研究，但根据计算模型，研究人员理论上推测的RNA酶数量庞大，涵盖从细菌到高等植物和动物的各种生物。现在，宾州州立大学的研究人员创造了一种新方法，使他们能够同时评估大量预测的核糖酶的活性。
研究小组探讨了2600多种被识别为属于一种名为“扭曲核糖酶”的RNA酶的RNA序列，这些酶可以自我裂解为两个部分。令人惊讶的是，测试的这些核糖酶中约94%显示出活性，表明它们即使在其结构中存在微小缺陷时也能有效功能。研究人员还通过识别哺乳动物中第一个扭曲核糖酶的实例，取得了突破性发现，该核糖酶位于瓶鼻海豚的基因组中。
关于这项研究的论文今天，即11月5日，在线发布在《核酸研究》杂志上。
宾州州立大学杰出的化学、生物化学和分子生物学教授Phil Bevilacqua领导了这项研究，他表示：“虽然DNA形成双链螺旋结构，但RNA是单链的，能够折叠成多种结构，例如环和螺旋。RNA酶的功能依赖于这些结构，它们可以被分为不同的组。我们专注于‘扭曲核糖酶’，因为它们能够自我裂解，而我们可以通过分析它们的基因序列来检测这一点。”
在这项研究之前，约有1600种扭曲核糖酶根据基因组序列和结构预测提出，但只有少数经过实验验证。研究小组创建了一种实验过程，使他们能够一次性评估数千种扭曲核糖酶的自我裂解行为，这一过程被称为“裂解高通量测定”，或称CHiTA。他们还通过仔细检查许多生物共享的短序列周围的基因组区域找到近1000个额外的核糖酶候选者。
CHiTA依赖于两个关键要素。第一个是名为“广泛并行寡核苷酸合成”（MPOS）的新技术，使团队能够设计并获取成千上万种不同的核糖酶序列，这些序列包装在一个小瓶中。每个序列的核心是2600种预测的核糖酶序列之一，附加的短DNA片段帮助放大DNA并将其转化为RNA以进行活性测试。
宾州州立大学的研究生、该研究的第一作者Lauren McKinley解释道：“通过MPOS，我可以轻松地汇总所需序列的列表，发送给供应商，并收到包含每种序列少量的溶液。对于CHiTA，我们需要每种序列的多个拷贝，因此我们在两端附加DNA片段，使我们能够使用名为PCR的技术复制出数百万个拷贝；然而，这些片段可能会影响核糖酶的功能。”
CHiTA的第二个关键要素通过使用一种限制酶解决了这一风险，该限制酶选择性地切割DNA，靠近识别位点而不留下任何可能影响核糖酶结构和功能的额外DNA。然而，大多数限制酶往往在其识别位点内切割，可能保留识别位点的部分，这可能会影响核糖酶。
“我们发现一种限制酶可以在远离其识别位点的地方切割DNA，使我们能够设计出不会留下残余物的序列，”McKinley说道。“这确保我们正评估核糖酶的确切序列。”
在实验室中，团队首先通过MPOS设计产生更多序列的拷贝，使用限制酶去除任何多余的DNA，然后从DNA序列中转录RNA。如果任何序列编码了活跃的核糖酶，它们将迅速折叠成其功能形式，并在RNA产生的同时自我裂解。研究人员随后可以收集RNA并将其转回DNA（cDNA），以分析其序列的完整性或裂解迹象。
“通过测序cDNA，我们可以确定有多少RNA，被裂解的RNA，作为核糖酶活性的指示，”McKinley指出。“在我们评估的序列中，有相当一部分显示出裂解迹象，约94%表现出活性。活跃核糖酶的裂解率与早期集中测试单个核糖酶的研究结果相符。”
在审查所测试序列的预测结构时，团队发现许多序列与标准扭曲核糖酶结构相比存在微小差异或缺陷，但它们仍然表现出自我裂解。这使研究人员得出结论，核糖酶对微小的结构变化具有相当大的耐受性，使它们能够在这些缺陷的情况下有效功能。
这种对结构差异的耐受性表明，自然界中可能存在更多扭曲核糖酶，可能无法通过传统搜索方法揭示。实际上，本研究开发的新描述符导致了在瓶鼻海豚基因组中发现第一个哺乳动物扭曲核糖酶。
“了解核糖酶如何容忍序列和结构变异将使我们能够设计出更有效的策略来识别它们，”Bevilacqua指出。“我们目前对核糖酶功能的理解主要源于化学研究，我们才刚刚开始揭示它们的生物角色。利用像CHiTA这样的规模化测定可以显著提升我们发现新核糖酶的能力，并加深我们对其细胞功能的理解。此外，这可能为了解RNA的进化历史及其在地球早期生命发展中的关键作用提供了洞见。”
研究团队包括McCauley O. Meyer、Aswathy Sebastian和Kyle J. Messina，他们在此期间都是研究生，并已获得博士学位；前本科生Benjamin K. Chang；以及生物信息学研究教授Istvan Albert。该研究的资金由国家卫生研究院和宾州州立大学Huck生命科学研究所提供。
